Filtru tal-fluworexxenza huwa komponent essenzjali fil-mikroskopju tal-fluworexxenza. Sistema tipika għandha tliet filtri bażiċi: filtru ta 'eċitazzjoni, filtru ta' emissjoni u mera dikroika. Huma komunement ippakkjati f'kubu sabiex il-grupp jiddaħħal flimkien fil-mikroskopju.
Kif jaħdem filtru tal-fluworexxenza?
Filtru ta 'eċċitazzjoni
Filtri ta 'eċċitazzjoni jittrasmettu dawl ta' wavelength speċifiku u jimblokkaw wavelengths oħra. Jistgħu jintużaw biex jipproduċu kuluri differenti billi jirfinaw il-filtru biex jippermettu kulur wieħed biss. Il-filtri ta 'eċitazzjoni jiġu f'żewġ tipi ewlenin - filtri pass fit-tul u filtri pass band. L-exciter huwa ġeneralment filtru bandpass li jgħaddi biss il-wavelengths assorbit mill-fluworophore, u b'hekk jimminimizza l-eċitazzjoni ta 'sorsi oħra ta' fluworexxenza u jimblokka d-dawl ta 'eċitazzjoni fil-faxxa ta' emissjoni tal-fluworexxenza. Kif muri mil-linja blu fil-figura, BP huwa 460-495, li jfisser li jista 'biss jgħaddi mill-fluworexxenza ta' 460-495nm.
Huwa mqiegħed fil-mogħdija ta 'illuminazzjoni ta' mikroskopju fluworexxenti u jiffiltra l-wavelengths kollha tas-sors tad-dawl ħlief għall-firxa ta 'eċitazzjoni tal-fluworofori. It-trażmissjoni minima tal-filtru tiddetta l-luminożità u l-brilliance tal-immaġini. Minimu ta' trażmissjoni ta' 40% għal kwalunkwe filtru ta' eċċitazzjoni huwa rakkomandat b'tali mod li t-trażmissjoni hija idealment >85%. Il-bandwidth tal-filtru tal-eċitazzjoni għandu jkun kompletament fil-medda tal-eċitazzjoni tal-fluworoforu b'tali mod li l-wavelength taċ-ċentru (CWL) tal-filtru jkun qrib kemm jista' jkun tal-wavelength tal-ogħla eċċitazzjoni tal-fluworophore. Id-densità ottika tal-filtru tal-eċitazzjoni (OD) tiddetta d-dlam tal-immaġni tal-isfond; OD huwa kejl ta 'kemm filtru jimblokka l-wavelengths barra mill-firxa tat-trasmissjoni jew bandwidth. OD minimu ta '3.0 huwa rakkomandat iżda OD ta' 6.0 jew akbar huwa ideali.
Filtru tal-Emissjoni
Il-filtri tal-emissjoni jservu l-iskop li jippermettu li l-fluworexxenza mixtieqa mill-kampjun tilħaq id-ditekter. Huma jimblokkaw wavelengths iqsar u għandhom trażmissjoni għolja għal wavelengths itwal. It-tip ta' filtru huwa assoċjat ukoll ma' numru, eż. BA510IF fil-figura (filtru tal-barriera tal-interferenza), dik id-denominazzjoni tirreferi għall-wavelength f'50% tat-trażmissjoni massima tiegħu.
L-istess rakkomandazzjonijiet għall-filtri tal-eċitazzjoni jgħoddu għall-filtri tal-emissjoni: trażmissjoni minima, bandwidth, OD, u CWL. Filtru ta 'emissjoni bil-kombinazzjoni CWL, trażmissjoni minima u OD ideali jipprovdi l-aktar immaġini brillanti possibbli, bl-imblukkar l-aktar profond possibbli, u jiżgura l-iskoperta tas-sinjali ta' emissjoni l-aktar dgħajfa.
Mera Dikroika
Il-mera dichroic titqiegħed bejn il-filtru ta 'eċitazzjoni u l-filtru ta' emissjoni f'angolu ta '45 ° u tirrifletti s-sinjal ta' eċċitazzjoni lejn il-fluworofor waqt li tittrasmetti s-sinjal ta 'emissjoni lejn id-ditekter. Filtri dichroic ideali u splitters tar-raġġ għandhom tranżizzjonijiet qawwija bejn riflessjoni massima u trażmissjoni massima, b'riflessjoni > 95% għall-wisa 'tal-frekwenza tal-filtru ta' eċċitazzjoni u trasmissjoni ta '> 90% għall-wisa' tal-frekwenza tal-filtru tal-emissjoni. Agħżel il-filtru bil-wavelength tal-intersezzjoni (λ) tal-fluworophore f'moħħu, biex timminimizza d-dawl mitluf u timmassimizza l-proporzjon tas-sinjal tal-immaġni fluworexxenti għall-istorbju.
Il-mera dichroic f'din il-figura hija d-DM505, hekk imsejħa minħabba li 505 nanometri hija l-wavelength f'50% tat-trażmissjoni massima għal din il-mera. Il-kurva tat-trażmissjoni għal din il-mera turi trasmissjoni għolja 'l fuq minn 505 nm, tnaqqis qawwi fit-trażmissjoni lejn ix-xellug ta' 505 nanometru, u riflessjoni massima fuq ix-xellug ta '505 nanometru iżda xorta jista' jkollha xi trasmissjoni taħt 505 nm.
X'inhi d-differenza bejn il-filtri fit-tul u l-filtri tal-banda?
Il-filtri tal-fluworexxenza jistgħu jinqasmu f'żewġ tipi: pass twil (LP) u pass band (BP).
Il-filtri li jgħaddu fit-tul jittrasmettu wavelengths twal u jimblokkaw dawk iqsar. It-tul ta 'mewġ cut-on huwa l-valur f'50% tat-trażmissjoni tal-quċċata, u l-wavelengths kollha 'l fuq mill-cut-on huma trażmessi mill-filtri ta' passaġġ twil. Dawn huma ta' spiss utilizzati f'mirja dikrojċi u filtri ta' emissjoni. Filtri Longpass għandhom jintużaw meta l-applikazzjoni teħtieġ ġbir massimu ta 'emissjoni u meta diskriminazzjoni spettrali ma tkunx mixtieqa jew meħtieġa, li huwa ġeneralment il-każ għal sondi li jiġġeneraw speċi waħda emittenti f'kampjuni b'livelli relattivament baxxi ta' awtofluworexxenza fl-isfond.
Il-filtri tal-band pass jittrasmettu biss ċertu medda ta 'wavelength, u jimblokkaw oħrajn. Huma jnaqqsu l-crosstalk billi jippermettu biss l-aktar porzjon b'saħħtu tal-ispettru tal-emissjoni tal-fluworofori li jiġi trażmess, inaqqsu l-istorbju tal-awtofluworexxenza u b'hekk itejbu l-proporzjon tas-sinjal għall-istorbju f'kampjuni ta 'awtofluworexxenza ta' sfond għoli, li filtri ta 'pass twil ma jistgħux joffru.
Kemm-il tip ta 'settijiet ta' filtri fluworexxenti BestScope jista 'jipprovdi?
Xi tipi komuni ta 'filtri jinkludu filtri blu, ħodor u ultravjola. Kif muri fit-tabella.
| Filtru Set | Filtru ta 'eċċitazzjoni | Mera Dikroika | Filtru tal-Barriera | Lampa LED Wave Length | Applikazzjoni |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Metodu ta 'antikorpi fluworexxenti ·Aċidina oranġjo: DNA, RNA ·Auramine: Bacillus tat-tuberku ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Metodu ta 'antikorpi fluworexxenti ·Jodur tal-propidju: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Osservazzjoni awto-fluworexxenza ·DAPI: Tbajja tad-DNA ·Hoecest 332528, 33342: użat għat-tbajja’ tal-Kromożomi |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Katekolamini ·5-hydroxy tryptamine ·Tetracycline: Skeletru, Snien |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Settijiet tal-filtri li jintużaw fl-akkwisti tal-fluworexxenza huma ddisinjati madwar il-wavelengths ewlenin użati fl-applikazzjonijiet tal-fluworexxenza, li hija bbażata madwar l-aktar fluworofori użati. Għal din ir-raġuni, huma wkoll imsemmija wara l-fluworophore li huma maħsuba għall-immaġini, bħal kubi tal-filtri DAPI (blu), FITC (aħdar) jew TRITC (aħmar).
| Filtru Set | Filtru ta 'eċċitazzjoni | Mera Dikroika | Filtru tal-Barriera | Lampa LED Wave Length |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Aħmar | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Kif tagħżel filtru tal-fluworexxenza?
1. Il-prinċipju tal-għażla tal-filtru tal-fluworexxenza huwa li tħalli d-dawl tal-fluworexxenza/emissjoni jgħaddi mit-tarf tal-immaġini kemm jista 'jkun, u jimblokka kompletament id-dawl tal-eċitazzjoni fl-istess ħin, sabiex tikseb l-ogħla proporzjon tas-sinjal għall-ħoss. Speċjalment għall-applikazzjoni ta 'eċċitazzjoni multifoton u mikroskopju ta' riflessjoni interna totali, il-ħoss dgħajjef se jikkawża wkoll interferenza kbira għall-effett ta 'l-immaġini, għalhekk ir-rekwiżit għal proporzjon ta' sinjal għal storbju huwa ogħla.
2. Kun af l-eċitazzjoni u l-ispettru tal-emissjoni tal-fluworofor. Biex jinbena sett ta 'filtri ta' fluworexxenza li jiġġenera immaġni ta 'kwalità għolja u b'kuntrast għoli bi sfond iswed, il-filtri ta' eċċitazzjoni u emissjoni għandhom jiksbu trażmissjoni għolja b'ripple minimu tal-passband fuq ir-reġjuni li jikkorrispondu mal-qċaċet jew emissjonijiet tal-eċitazzjoni tal-fluworofori.
3. Ikkunsidra d-durabilità tal-filtri tal-fluworexxenza. Dawn il-filtri għandhom ikunu impermeabbli għal sorsi ta 'dawl intens li jiġġeneraw dawl ultravjola (UV) li jista' jwassal għal "burnout", b'mod partikolari tal-filtru eċċitanti peress li huwa soġġett għall-intensità sħiħa tas-sors ta 'illuminazzjoni.
L-Immaġini tal-Kampjun Fluworexxenti Differenti
Ir-riżorsi jinġabru u jiġu organizzati fuq l-Internet, u jintużaw biss għat-tagħlim u l-komunikazzjoni. Jekk ikun hemm xi ksur, jekk jogħġbok ikkuntattjana biex tħassar.
Ħin tal-post: Diċ-09-2022